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28 Março 2024

Experiência 3

Experiência 3: Estudo da Inversão da Sacarose

 

Introdução Teórica
Modo de Proceder
Ilustração do tratamento de resultados experimentais
Cuidados Especiais
Materiais
Deposição de Resíduos
Relatório Modelo
Referências
Agradecimentos 

 

1. Introdução Teórica:

O objectivo específico deste trabalho prático é o estudo da reacção de inversão da sacarose, reacção de hidrólise originando frutose e glicose, conduzida num reactor catalítico de leito fixo. São propostos dois catalisadores: uma resina de permuta catiónica forte e uma enzima imobilizada, especializada na catálise desta reacção, a invértase. A conversão em estado estacionário nos reactores é seguida usando uma técnica analítica conhecida por FIA (Flow Injection Analisys). São ainda objectivos deste trabalho prático a familiarização do estudante com problemas específicos de reacções catalíticas e enzimáticas, bem como o contacto com a técnica de análise FIA. 

A reacção de hidrólise da sacarose (+) pode escrever-se como: 

Formula(1)
             (Sacarose, 342 u.m.a.)             (Glucose, 180 u.m.a.) (Frutose, 180 u.m.a.) 

A sacarose (+) tem um poder específico de rotação óptica de +66,5º, enquanto a mistura equimolar de frutose (-) mais glicose (+) têm um poder específico de rotação óptica. A glicose e a frutose são estereo-isómeros.

A reacção de inversão da sacarose é catalisada acidicamente, sendo uma reacção de primeira ordem. A catálise homogénea em solução aquosa da sacarose implicaria no final a separação dos produtos de reacção do catalisador ácido. Uma forma mais prática de conduzir esta reacção consiste na “imobilização” do catalisador. Uma resina de permuta catiónica, na forma protónica, não é mais do que um “ácido imobilizado”, em que o anião está ligado covalentemente à estrutura tridimensional da resina e o catião H+ ligado a este grupo ionicamente.

A inversão da sacarose é uma reacção com energia de activação muito elevada, cerca de 15 950 cal mol-1 (66,67 kJ mol-1) para partículas de diâmetro médio 0,715 mm De Amberlite IR 120 [1]. Trata-se assim duma reacção muito sensível à temperatura. Esta reacção é controlada pela cinética de transporte (controlo difusional), ou seja, pela difusão da sacarose no interior da partícula e dos produtos de reacção para o exterior. É fácil de verificar isto mesmo usando diâmetros de resina progressivamente menores. Gilliand et al. [2] apresentam resultados para a inversão da sacarose catalisada pela resina de permuta catiónica Dowex 50W-X8, a 50ºC, que resumimos na tabela 1.

Tabela 1 - Dados cinéticos relativos à inversão da sacarose catalisada pela resina Dowex 50W-X8

dp(mm) k/k0.04(1)  Φ=rp √k/De  η
0.04             1.0 0.57 0.98
0.27 0.568 3.90 0.55
0.55 0.335 7.80 0.332
0.77 0.252 10.9 0.224

(1) k0.04 - Constante cinética aparente para partículas com diâmetro 0.04 mm.

O factor de eficiência (η), definido como a razão entre a velocidade de reacção para as condições à superfície do catalisador, é função do módulo de Thiele (Φ):

Formula(2)

onde ρ é o raio da partícula de catalisador, k a constante cinética e De a difusividade efectiva. Para catalisadores com simetria esférica e cinética de primeira ordem, η é dado por:

Formula (3)

Na figura 1 é representada graficamente a dependência do factor de eficiência (η) em função do módulo de Thiele (Φ). Para valores suficientemente elevados de Φ, encontramo-nos na região do controlo difusional, onde η≈1/Φ, enquanto que para valores de Φ suficientemente pequenos, encontramo-nos na região de controlo químico, onde η≈1. Para reacções de primeira ordem e catalisadores de simetria esférica, normalmente considera-se que para Φ < 0.4 estamos em regime químico e para Φ > 4 estamos em regime difusional [10].

Factor de eficiência em função do módulo de Thiele, para um catalisador esférico
Figura 01: Factor de eficiência em função do módulo de Thiele, para um catalisador esférico.

Conhecendo a constante cinética aparente para os dois tamanhos de partículas de catalisador, é possível obter o factor de eficiência e o módulo de Thiele:

Formula(4)

E pela definição de módulo de Thiele (equação (2)) vem:

Formula (5)

Introduzindo agora as equações (3) e (5) na equação (4) de rearranjando, vem:

Formula (6)

Esta equação pode agora ser resolvida em ordem a Φ1. A partir deste valor é possível obter Φ2 (equação (5)), η1 (equação (3)) e η2 (equação (4)), para reacções de ordem 1.

A energia de activação aparente pode ser obtida a partir da lei de Arrhenius:

 

Formula
(7)

onde k0aparente é o factor de frequência aparente e Eaparente a energia de activação aparente, conhecendo as constantes cinéticas aparentes a pelo menos duas temperaturas, mas preferencialmente a três. Diz-se energia de activação aparente porque também inclui a energia de activação relativa ao transporte de massa.

Seguidamente, ilustra-se uma análise quantitativa do comportamento de uma resina com dois tamanhos de partículas diferentes.

A constante cinética da inversão da sacarose catalisada por uma resina de permuta catiónica Amberlite IR 120 foi determinada por Reed e Dranoff [1] a 70ºC para partículas com diâmetro médio 0,715 e 0,505 mm. Estes autores registaram os valores de k= 0,168 min-1 e k=0,226 min-1 respectivamente para os dois tamanhos de partículas. As constantes cinéticas obtidas foram baseadas no volume total do reactor, admitindo que a concentração de centros activos era constante e independente do tamanho da resina.

Para um escoamento cujo número de Reynolds seja inferior a 100, o Peclet de partícula de um leito fixo varia entre 0,3 e 1, para líquidos. [3] Tomando um valor intermédio, Pe= 0,6, para Peclet da partícula, para uma coluna com comprimento útil de 10 cm em partículas de 0,505 mm de diâmetro, o número de Peclet do leito vem:

Formula(8)


sendo dp o diâmetro médio das partículas e L o comprimento da coluna. Chung e Wen [4] propuseram uma outra expressão para cálculo do número de Peclet, válida para colunas de enchimento com partículas inertes não porosas: 

Formula
(9)

Para um caudal de cerca de 10 cm3min-1, num leito com 2,5 cm de diâmetro interno e aproximando a massa específica e viscosidade da solução à da água a 20ºC, vem:

Formula(10)

onde ε é a porosidade do leito, u é a velocidade superficial e ρ é a massa específica e μ a viscosidade da solução. A porosidade do leito e a massa específica da resina foram obtidas com o auxílio de uma proveta graduada e de uma balança analítica. Os valores obtidos foram ε=0,55 e ρ=1,27 gcm-3 (na literatura da resina o valor da massa específica é ρ=1,28 gcm-3, e.g. [5]).

Para reacções de primeira ordem isotérmica, se conhecermos a distribuição dos tempos de residência E(t), podemos obter a conversão em estado estacionário a partir da expressão seguinte [6]:


Formula(11)

e substituindo a razão CSac(t)/CSac0 para uma reacção de primeira ordem, vem:


Formula(12)

onde k, a constante cinética da reacção, vem referida ao volume total do reactor.

A distribuição dos tempos de residência para um reactor pistão com dispersão axial e semi-infinito tem solução analítica [6]:


Formula(13)

onde τ é o tempo de residência médio, referido ao volume total do reactor. Mais uma vez, para números de Peclet relativamente elevados, as condições-fronteira influenciam pouco a conversão em estado estacionário.

Finalmente, introduzindo a equação (13) na equação (12), obtemos:


Formula(14)

que pode ser resolvida facilmente numa calculadora ou com o auxílio de um computador pessoal.

Para um reactor pistão (Pe =), a equação anterior vem simplesmente:


Formula(15)

Para um comprimento útil do reactor de 19cm, 2,5 cm de diâmetro interno e um caudal de alimentação de 10 cm3min-1, o tempo de residência baseado no volume total do reactor vem:


Formula(16)

e, assim, para as partículas de catalisador de diâmetro médio 0,505 mm e considerando que o número de Peclet é bem estimado pela equação (9), a conversão em estado estacionário à temperatura de 70ºC pode ser calculada:

Formula(17)

ou para escoamento pistão:

Formula(18)

Do mesmo modo pode ser obtida a conversão em estado estacionário relativo às partículas de diâmetro 0,715 mm. Para estas partículas, o número de Peclet estimado pela equação (9) é Pe=99.3. Considerando a mesma porosidade, a conversão em estado estacionário a 70ºC vem:

Formula(19)

E de novo para escoamento pistão: 

Formula(20)

O desempenho do reactor contendo as partículas de catalisador mais pequenas é claramente superior. Podemos agora obter o factor de eficiência relativamente aos dois tamanhos de partículas assim como os respectivos módulos de Thiele. Chamemos (1) ás partículas de diâmetro médio 0,715mm e (2) às partículas de diâmetro médio 0,505mm. Resolvendo a equação (6) em ordem a Φ1, e para escoamento pistão com dispersão axial, vem:

FormulaFormula(21)

usando o método de Newton, vem Φ1=9,34. Φ2 pode agora ser obtido a partir da equação (5):

Formula(22)

η1 é obtido a partir da equação (3):

Formula(23)

e η2 da equação (4):

Formula(24)

Como era esperado, o factor de eficiência relativo às partículas menores é maior. Mesmo assim, o factor de eficiência relativo às partículas pequenas é baixo (38,6%) e será desejável aumentar a eficiência do transporte de massa nas partículas. Isto pode ser feito, para uma determinada temperatura de reacção, diminuindo o seu tamanho e/ou modificando a distribuição dos poros. A diminuição do tamanho das partículas corresponde a um aumento da perda de carga na coluna, o que acima de determinados valores se pode tornar impraticável. Assim, no mercado surgiram novas resinas, ditas macrorreticuladas, mais rígidas e com poros mais largos, tendo uma eficiência catalítica superior. Entretanto, ao alargamento do diâmetro dos poros corresponde uma diminuição da área específica interna e assim uma menor concentração de centros activos. O diâmetro médio do catalisador, bem como a sua distribuição de tamanho de poros, têm, assim, de ser optimizados de forma a obter o melhor desempenho de um reactor catalítico.

A reacção de hidrólise da sacarose pode ainda ser catalisada enzimaticamente. A invértase, ou β-fructosidase, catalisa a reacção de hidrólise da sacarose de forma muito eficiente se as condições do meio forem as óptimas. No caso da β-fructosidase estas condições são pH 4,6 e 55ºC. A hidrólise enzimática da sacarose segue uma cinética de Michaelis-Menten:

Formula(25)

onde rsac é a velocidade de reacção da sacarose, rmax a velocidade máxima de reacção e KM a constante de Michaelis-Menten, rmax e KM, implica a realização de experiências preferencialmente em reactores fechados. É possível linearizar a equação (25) e ajustá-la aos valores experimentais da concentração de sacarose em função do tempo, obtendo desta maneira os dois parâmetros do modelo. Os resultados experimentais em reactores abertos podem também ser usados para o mesmo fim, embora o tratamento de resultados seja, neste caso mais complexo. No entanto, e no âmbito deste trabalho, as constantes do modelo de Michaelis-Menten não serão estimadas.

 

2. Modo de Proceder

A instalação laboratorial relativa à reacção de inversão da sacarose pode ser dividida em duas partes: o reactor catalítico e o sistema de detecção ou análise. Na Figura 2é apresentado o esquema da instalação laboratorial. Analise-o cuidadosamente.

Esquema da istalação experimental
Figura 02: Esquema da istalação experimental.

Dispõe de três reactores com camisas de vidro, iguais, com 25 mm de diâmetro interno e com um comprimento útil máximo de 25 cm, mas regulável por manipulação de um pistão. Os dois primeiros contêm uma resina de permuta catiónica forte, Ambertite IR 120, sob a forma protónica, enquanto o terceiro contém uma enzima, invértase, imobilizada em alginato de cálcio. O diâmetro volumétrico da resina de permuta iónica no primeiro reactor (reactor amarelo) é de 0,88 mm e no segundo de 0,31 mm (reactor verde), enquanto as partículas de alginato de cálcio apresentam um diâmetro volumétrico entre 2 e 3 mm (reactor vermelho). A resina de permuta catiónica usada tem uma distribuição de tamanho de partículas larga. Para obter as duas fracções usadas nos reactores amarelo verde, 2 kg de resina comercial foram peneirados usando crivos de diferentes malhas. A primeira fracção foi obtida usando crivos com malhas de 1,00 e 0,71 mm, enquanto a segunda foi obtida usando crivos com malhas de 0,355 e 0,250 mm.

Através de duas válvulas direccionais poderá seleccionar a corrente de alimentação e de recolha do produto relativa a cada um dos três reactores. A saída do produto faz-se através duma ligação em ‘‘T’’ seguida de uma válvula direccional de três vias. Durante a operação dos reactores, o excesso de produto é recolhido como ‘‘resíduo’’, sendo uma pequena fracção bombeada para o sistema de análise. Durante a calibração do sistema de análise, a válvula direccional é reorientada de forma a impedir a entrada de produto neste sistema.

A temperatura dos reactores é controlada através de dois banhos termostáticos. O primeiro está ligado aos reactores que contêm a resina de permuta catiónica (amarelo e verde) e o segundo ao reactor enzimático (vermelho). A temperatura de trabalho dos reactores catalíticos amarelo e verde é de 70ºC. Esta temperatura foi escolhida por ser suficientemente alta de forma a reacção se dar na extensão desejada e o controlo reaccional ser de natureza difusional mas não tão elevada que a evaporação da água do banho termostático seja significativa ou que a desgaseificação da solução de alimentação no interior da coluna cause uma apreciável formação de bolhas na coluna. A temperatura óptima de trabalho do reactor enzimático é 55ºC. Pelo que o ponto estabelecido (set-point) do banho termostático deve ser também este valor.

A determinação da conversão dos reactores é feita medindo a concentração em glicose na corrente de produto, através de um método de análise designado por FIA – Flow Injection Analysis, que poderemos traduzir por Análise por Injecção na Corrente. Este método analítico baseia-se na adição de um reagente específico à solução a analisar. Por reacção com o composto-problema, este reagente produz um produto corado, cuja concentração é proporcional à concentração do composto-problema. A concentração do composto-problema pode então ser aferida por medição da absorvância da solução final resultante.

Observemos agora o esquema da válvula de injecção usada o método de análise (Figura 3).

Esquema da válvula de injecção: a) posição de carga; b) posição de injecção
Figura 03: Esquema da válvula de injecção: a) posição de carga; b) posição de injecção.

Na posição de carga, a amostra de solução a analisar e a solução do reagente estão a circular através das duas voltas (loops) da válvula, enquanto a solução transportadora, que tem aqui um papel semelhante ao desempenhado pelo hélio em cromatografia gasosa, entra e sai sem qualquer interferência. Quando é feita a injecção, a solução transportadora passa a ‘‘arrastar’’ o reagente e a amostra, inicialmente contidos nas duas voltas da válvula, um volume seguido de outro – Figura 3. Reagente e amostra são transportados ao longo de um tubo, mais ou menos longo, onde tem lugar a mistura, por dispersão axial e radial, do reagente com a amostra, ocorrendo aí a reacção entre eles. O diâmetro dos tubos varia mas deverá permitir que o escoamento no seu interior seja laminar. Este diâmetro é normalmente em FIA de 0,8 mm.

No caso presente, o reagente é uma solução tamponada de glucosidase e peroxidase (GOD-PAP da Boehringer Mannheim). As enzimas têm normalmente uma actividade que depende muito do pH da solução, donde a necessidade de tamponar a solução que as contém. A glucosidase catalisa de forma específica a oxidação da glicose a gluconato:

Formula(26)

mas é o peróxido de hidrogénio formado nesta reacção que vai produzir um composto corado, a (p-benzoquinona-mono-imino)fenazona, por reacção com o fenol e com a aminofenazona, contidos na solução-tampão, segundo a reacção:

Formula(27)

O pico de absorvância do composto corado verifica-se a 510 nm. Este deve ser o comprimento de onda seleccionado no espectrofotómetro usado.

Um sistema FIA é composto por quatro componentes: 1) sistema de bombagem; 2) válvula de injecção; 3) sistema de transporte e reacção; 4) sistema de detecção.

O sistema de bombagem é, no caso presente, constituído por uma bomba peristáltica de muito baixa pulsação (a cabeça da bomba tem 12 rolos). Este facto é importante pois de outra forma a passagem do pico de concentração da solução corada através da célula de fluxo contínuo do espectrofotómetro seria muito rápida, ou menos rápida – pulsação –, afectando a medição da absorvância.

O sistema de injecção é constituído por uma válvula de 10 vias e duas posições, tendo duas voltas (loops). A volta relativa do reagente é cerca de 4 vezes maior que a volta relativa à amostra e esta é transportada à frente do reagente – Figura 3. A razão de volumes e a posição de injecção da amostra/reagente foram optimizadas de forma a conseguir a máxima sensibilidade do método. A rotação da bomba peristáltica é regulada de forma a que o tempo de residência no sistema de reacção seja tal que a reacção de formação de cor se dê na extensão desejada.

O sistema de transporte e reacção é constituído por um tubo de teflon de 0,8 mm de diâmetro interno. Este é ainda o diâmetro interno do caminho óptico da célula do espectrofotómetro e das voltas e tubos de ligação da válvula. À saída da válvula de injecção, parte do tubo que conduz o reagente e amostra ao espectrofotómetro encontra-se entrelaçado numa rede de arame de aço, de forma a promover a dispersão radial dos reagentes e assim aumentar a sensibilidade do sistema de análise, aumentando a extensão da reacção. É essencialmente neste local, indicado na Figura 2 como reactor, que se dá a reacção de identificação da glicose. De forma a manter a temperatura da reacção de identificação da glicose aproximadamente constante, a rede de aço que contém a maior parte do tubo onde se dá a reacção foi colocada no interior de um contentor termostático de poliestireno expandido (Figura 2). A temperatura do reactor deverá ser aproximadamente a temperatura ambiente, de forma o contentor termostático funcionar de forma mais eficiente e a fracção de tubo fora do contentor termostático não ter um peso significativo sobre o resultado da análise.

O sistema de detecção é constituído por um espectrofotómetro contendo uma célula de fluxo contínuo de quartzo com um volume interno de 18 μl. No sistema FIA a existência de bolhas de ar é crítica, uma vez que depois de formadas são arrastadas pela corrente e podem fixar-se na célula do detector. Assim, é importante a desgaseificação da água destilada usada como transportador. Esta desgaseificação deve ser feita borbulhando hélio na água. O hélio é um gás praticamente insolúvel, que ao borbulhar faz baixar a pressão parcial do ar na fase gasosa e origina assim a sua desorção. A desgaseificação pode, no entanto, ser feita de forma mais prática usando um módulo de membranas de teflon. A fita de teflon usada em pincelaria pode ser usada para este fim. Este filme de teflon é hidrofóbico e extremamente poroso, permitindo a saída do ar.

Embora em FIA a propriedade alterada por adição do reagente específico seja normalmente a cor, é possível também a adição de reagentes que alterem a condutividade, o índice de refracção ou outras propriedades. A essência do FIA está em ser uma técnica de análise simples e facilmente automatizada, com um consumo baixo de reagente específico.

Inicie a experiência inspeccionando toda a instalação experimental, verificando nomeadamente a posição das válvulas direccionais, os tubos de ligação dos reactores e do FIA, os reactores catalíticos, os pontos estabelecidos (set-point) dos banhos termostáticos, as rotações das bombas peristálticas, a concentração das soluções reagentes disponíveis etc. Verifique ainda a existência de uma bolha de ar dentro dos reactores, na sua parte superior e acima do catalisador. A sua presença é indispensável! Imagine que as válvulas direccionais estavam direccionadas para o reactor amarelo. Imagine ainda que ligava os banhos termostáticos. Os reactores verde e vermelho estão completamente fechados, tanto a sua entrada como a sua saída. À medida que a temperatura sobe nos banhos termostáticos, a pressão dentro destes reactores também sobe. O reactor amarelo, uma vez que está ligado à saída, não tem problemas, mas nos reactores verde e vermelho a pressão pode subir tanto que pode originar o rebentamento dos reactores, ou a danificação do material auxiliar. Verifique assim se existe ar na parte superior dos reactores, acima do catalisador, de cerca, de 1 cm de comprimento. Só depois ligue os banhos termostáticos e coloque a temperatura estabelecida (set-point) em 70ºC no banho ligado aos reactores com resina e 55ºC no banho ligado ao reactor enzimático. Faça passar água através da célula do espectrofotómetro com a ajuda da bomba peristáltica (20 rpm) e atribua absorvância zero à absorvância lida.

Nota – Uma vez que a transmitância da célula usada é muito pequena, o arranque do espectrofotómetro deverá seguir o seguinte procedimento experimental, não convencional: 1) retire a célula do seu suporte, feche a tampa do espectrofotómetro e ligue-o. Aguarde o tempo necessário até ao seu completo arranque; 2) volte a colocar a célula no seu lugar e feche a tampa; 3) verifique o comprimento de onda seleccionado. Este deverá ser 510 nm; 4) ligue a bomba peristáltica e faça passar água na célula do espectrofotómetro. Depois de estabilizar, faça o zero do espectrofotómetro com o auxílio da tecla Cal. Está pronto a trabalhar!

Depois inicie a calibração do método de análise. Deverá em primeiro lugar desgaseificar com hélio a água destilada usada como transportador do FIA. O método de análise foi optimizado para a medição de concentrações entre 0,1 e 4 gdm-3 em glicose. Dispõe de quatro soluções - padrão de glicose em água, com concentrações de 1, 2, 3 e 4 gcm-3. Direccione a válvula de três vias – Figura 2 – correctamente e introduza o tubo de pesca no balão que contém o padrão com concentração mais elevada. Introduza ainda o tubo de pesca do transportador num copo contendo cerca de 300 cm3 de água destilada e desgaseificada. Verifique se a solução da enzima no frasco de alimentação é suficiente para toda a experiência, ou seja, verifique se o frasco está praticamente cheio. Caso contrário, encha o frasco de alimentação com a solução enzimática contida no frasco de recolha. A solução enzimática é muito cara (custa cerca de €15 o frasco) e deverá ser reciclada durante uma semana. Esta é aproximadamente a validade da solução, quando armazenada à temperatura ambiente, visto as enzimas serem biodegradáveis. No entanto devido à contaminação provocada pela entrada de solução transportadora durante a operação da válvula de injecção – ver Figura 3 –, o desempenho da solução enzimática pode vir um pouco mais afectado.

Regule agora a bomba peristáltica do FIA para 20 rotações por minuto e ligue-a. A concentração em glicose da amostra é proporcional à altura do pico obtida, ou seja, à absorvância máxima. Registe pelo menos dois picos concordantes (diferindo em altura/absorvância máxima menos de 1%) de cada solução-padrão.

Na Figura 4 é apresentado um exemplo duma curva de calibração.

Exemplo de uma curva de calibração do método de análise
Figura 04: Exemplo de uma curva de calibração do método de análise.

Nota –  Se durante a calibração do método de análise os valores de absorvância obtidos para o mesmo padrão, entre injecções, diferirem sistematicamente mais do que 1%, muito provavelmente isso significa que as voltas (loops) do padrão e/ou com a solução enzimática não estão completamente cheias com o padrão e/ou com a solução enzimática e é necessário aguardar mais tempo entre injecções para que encham completamente. Isto acontece porque o escoamento nas voltas e tubos de ligação é essencialmente laminar.
Uma solução expedita para este problema poderá passar por aumentar a rotação da bomba peristáltica do sistema de análise. Assim, logo após o valor máximo do pico aparecer no monitor do computador, poderá colocar a válvula de injecção na posição de enchimento e acelerar a rotação da bomba peristáltica para a velocidade máxima ou próximo da máxima. Deverá manter a bomba nesta rotação cerca de 60 segundos, se se tratar duma primeira injecção (novo padrão), ou 30 segundos se se tratar duma segunda injecção. No final, deverá reduzir a velocidade de rotação da bomba para o valor normal e mantê-la nesta rotação mais cerca de 15 segundos. Em princípio já poderá fazer uma nova injecção em segurança.

Nota – O escoamento nos tubos do FIA é essencialmente laminar. Assim, quando se muda de uma solução de calibração para outra, esta última é facilmente contaminada pela primeira. Uma forma de minimizar esta contaminação, sem contudo gastar quantidades significativas de reagentes ou de tempo, é deixar entrar uma pequena bolha de ar no tubo de pesca. Esta bolha modifica o escoamento, aproximando-o a um escoamento pistão.

Nota – Depois de sair o pico correspondente à reacção da glicose com o reagente específico, no sistema FIA, a absorvância baixa a valores negativos, especialmente para os padrões de glicose com concentração mais baixa. Isto acontece porque a solução-tampão e o transportador (água destilada) têm índices de refracção diferentes, provocando a sua mistura por circulação nos tubos um efeito de concentração da luz, conhecido por efeito de Schlirren.

Nota – Se não obtiver, a partir da segunda injecção, dois picos concordantes, deverá tentar identificar qual a origem do problema. Em último caso deverá desprezar os picos que claramente estão afectados por erros grosseiros e fazer uma série de pelo menos 4 injecções de forma a que o erro venha minimizado.

Nota – A resposta do espectrofotómetro é linear com a concentração (lei de Beer) para uma absorvância máxima entre 0,8 e 0,9. Quando basear o seu método analítico na linearidade da resposta do espectrofotómetro, evite soluções que originem absorvâncias mais elevadas.

Uma vez que cada análise demora cerca de 3 minutos, quando estiver a analisar a penúltima solução de calibração, condicione cerca de 450 cm3 de solução 7,6 gdm3 de sacarose (disponível) num matraz de 500 cm3, à temperatura do banho termostático, de forma a retirar o ar dissolvido. Esta operação deverá durar cerca de 10 minutos. Mantenha o matraz tapado, de forma a não concentrar a solução. O espaço livre acima da solução é indispensável para que, durante o aumento de pressão originado pelo aumento da temperatura, o matraz não parta. De seguida, redireccione as duas válvulas de direcção para o reactor amarelo (Figura 5) e regule a velocidade de rotação da bomba peristáltica de forma a obter um caudal de cerca de 10 a 15 cm3min-1 (10 a 30 rpm). Ligue a bomba peristáltica. Meça o caudal de alimentação, pelo menos três vezes. Nestas condições, o estado estacionário deste reactor leva cerca de 10 a 15 minutos a ser atingido.

Nota – Porque é que a concentração da sacarose é 7,6 gdm-3? Será que isso tem a ver com o limite superior de detecção de glicose do sistema de análise?

Nota – Tenha muita atenção para não deixar entrar ar nos reactores. É difícil retirar as bolhas de ar presas nos reactores, especialmente os que contêm resina, e a sua presença reduz de forma drástica a transferência de massa, diminuindo assim a capacidade catalítica do reactor.

Após analisar todos os padrões, redireccione a válvula de três vias para a entrada da solução vinda do reactor amarelo (Figura 5), no sistema de análise. Se, entretanto, o estado estacionário tiver sido atingido, espere o tempo necessário para encher a volta (loop) da válvula de injecção e faça uma injecção. Obtenha pelo menos dois picos concordantes, diferindo pelo menos de 1%. Não se esqueça de deixar entrar um pouco de ar de forma a minimizar a contaminação proveniente da análise anterior. No final deixe passar um pouco de água destilada e desgaseificada a 70ºC no reactor durante cerca de 5 min e à máxima rotação. Isto é muito importante para evitar, ou diminuir, o desenvolvimento de microrganismos no seu interior.

Esquema da instalação experimental. A válvula de três vias foi direccionada para recolher amostras dos reactores
Figura 5: Esquema da instalação experimental. A válvula de três vias foi direccionada para recolher amostras dos reactores.

Condicione mais 450 cm3 da solução de 7,6 gdm-3 de sacarose e repita o anterior agora para o reactor verde.

Como já foi referido, as enzimas são normalmente muito sensíveis ao pH do meio. A invértase imobilizada no alginato de cálcio, que constitui o enchimento do reactor vermelho, não é excepção. Assim, a sacarose deverá ser alimentada ao reactor numa solução-tampão de acetato de acetato de sódio 0,02 M e pH 4,6. De facto, a actividade da invértase quase duplica quando a alimentação passa de pH neutro para pH 4,6. A solução-tampão deverá ainda conter cloreto de cálcio. A presença do ião cálcio é indispensável para impedir que o alginato de cálcio volte a alginato de sódio, libertando assim a enzima. O ião cálcio deverá estar na proporção de 25:1 com o ião sódio. No entanto, o cloreto de cálcio numa concentração superior cerca de 0,02 M interfere de forma significativa com o método usado de doseamento da glicose. Assim, vamos simplesmente adicionar ácido acético à solução de sacarose de alimentação, de forma a perfazer uma concentração em ácido de cerca de 6x10-5 M. Uma vez que a constante de dissociação do ácido acético é Ka=1.75x10-5 [7], o pH da solução final deverá vir aproximadamente 4,6.

Nota – No caso de pretendermos preparar 5 dm3 de solução contendo sacarose com uma concentração 7,6 gdm3 e ácido acético 6x10-5 M, poderemos fazê-lo do seguinte modo: adicionamos 38 g de sacarose e 0,06 cm3 de ácido acético 1 M (equivalente, pode pesar-se 0,018 g de ácido acético glacial) a uma quantidade suficiente de água destilada e desionizada de forma a perfazer 5 dm3 de solução e homogeneizamos a solução assim preparada.

Nota – Foi dito que a reacção de inversão da sacarose era catalisada acidicamente. Será então que o ácido acético, para além de baixar o pH do meio e assim aumentar a actividade da enzima, não catalisa efectivamente a reacção? Foi verificado que 5 dias depois de pôr uma solução de sacarose em contacto com o ácido acético 6x10-5 M não foi possível detectar qualquer vestígio de glicose usando o método de análise atrás descrito.

Uma vez que o ácido acético na concentração usada não interfere significativamente com o processo de análise, não é necessário fazer uma nova calibração. Entretanto, em análises mais rigorosas uma nova calibração deveria ser feita, usando não só soluções-padrão de glicose e tampão, como transportador deveria ser ele mesmo uma solução tamponada. Condicione assim cerca de 450 cm3 de solução 7,6gdm3 de sacarose de sacarose e 6x10-5 M de ácido acético (disponível) num matraz de 500 cm3, à temperatura do banho termostático, durante cerca de 10 min, de forma a retirar o ar dissolvido e a entrada no reactor ser à temperatura desejada de 70°C.

Tape o matraz, de forma a diminuir a evaporação do ácido acético. Repita o procedimento anterior para a determinação da conversão em estado estacionário do reactor enzimático (reactor vermelho). Verifique o caudal de alimentação a este reactor. O valor típico ao qual o estado estacionário é atingido é entre 100 e 150% do tempo de passagem do reactor. Para um caudal de aproximadamente 10 cm3min-1, a que corresponde habitualmente uma rotação de 20 rpm da bomba peristáltica, isto significa que o estado estacionário se estabelecerá cerca de 15 min depois do reactor ser arrancado.

A imobilização da invértase tem duas funções. Em primeiro lugar fixa a enzima, que é bastante dispendiosa (cerca de €60 por 1 g), a um suporte que permite a sua reutilização. Em segundo lugar, confere à própria enzima uma maior estabilidade e longevidade. As enzimas são facilmente biodegradáveis e a vida útil da invértase em solução a 4ºC (temperatura de conservação) é cerca de uma semana, enquanto que liofilizada a 4ºC tem uma vida útil de cerca de 2 anos.

Embora não faça parte da execução experimental, descreve-se seguidamente como pode ser feita a imobilização da enzima em alginato de cálcio. Começa-se por preparar cerca de 200 cm3 duma solução aquosa de alginato de sódio cerca de 1% em peso. Esta solução, muito viscosa, tem uma consistência próxima da de um gel. A sua homogeneização é difícil e recomenda-se que esta solução seja misturada usando um agitador magnético durante pelo menos uma hora. O alginato de sódio é um polissacarídeo extraído das algas. À solução aquosa de alginato de sódio adiciona-se quantidade desejada de invértase, neste caso cerca de 250 mg. De seguida, bombeia-se esta solução através duma bomba peristáltica e deixa-se cair, gota a gota, sobre uma solução agitada de cloreto de cálcio aproximadamente 0,2 M. Ao cair nesta solução, o ião sódio permuta com o ião cálcio, dando origem a uma estrutura polimérica reticulada semi-rígida. As gotas devem cair de duma altura de cerca de 20 cm, de forma a que se obtenham partículas com simetria aproximadamente esférica. O tubo da bomba peristáltica deverá ter um diâmetro conveniente para que as partículas formadas tenham um diâmetro aproximado de 3 mm. As partículas formadas de alginato devem permanecer na solução de cloreto de cálcio durante cerca de 3 horas. O alginato de cálcio é estável entre 0 e 100ºC.

A reacção da hidrólise enzimática da sacarose segue uma cinética de Michaelis-Menten. Assim, para uma concentração suficientemente elevada de substracto, a cinética da reacção passa a ser de ordem zero e a correspondente constante cinética vem igual ao parâmetro velocidade máxima da reacção rmax. A actividade duma enzima é normalmente medida em termos de unidades (U) por unidade de massa dessa enzima, nas condições em que a cinética é de ordem zero. Uma unidade (U) é a actividade duma enzima, a qual, em condições normalizadas óptimas (temperatura, pH e concentração de substrato), é capaz de catalisar 1 μmol min-1 de substracto (reagente). A invértase (β-fructosidase, 270 000 u.m.a.) utilizada no presente trabalho tem uma actividade de 300 U mg-1 a 55ºC e pH 4,6, ou seja, 1 mg de invértase é capaz de catalisar 300 μmol min-1 de sacarose nas condições óptimas normalizadas de operação, incluindo nas condições em que a cinética é de ordem zero. No presente trabalho experimental, e para uma alimentação ao reactor de cerca de 10 cm3 min-1 duma solução de sacarose a 7,6 g dm3, ou seja, para uma alimentação de 76 mg de sacarose por minuto, a que corresponde 222 μmol de sacarose por minuto, são necessárias 222/300= 0,741 mg de invértase para conversão completa, se a cinética fosse de ordem zero. De facto, adicionamos cerca de 250 mg de invértase à solução de alginato de sódio. Existem sempre perdas de enzima, uma vez que nem todo o alginato de sódio é transformado em pequenas partículas de alginato de cálcio, nem todas as partículas de alginato de cálcio são colocadas no reactor e nem toda a enzima imobilizada no interior das partículas de alginato de cálcio se encontra acessível ou activa para catalisar a reacção de inversão da sacarose. Além disso, a concentração de substracto é da mesma ordem de grandeza da constante de Michaelis-Menten (KM varia entre 2 mM e 5 mM), ou seja, a cinética não é de ordem zero nas condições em que o reactor vai ser operado. As perdas de actividade da invértase podem ter origem química ou biológica, uma vez que a enzima é facilmente biodegradável.

No final coloque na banca para lavar todo o material usado. Limpe ainda a bancada com um pano e lixívia (use luvas e óculos de protecção para o fazer). Este procedimento visa retirar da bancada todos os resíduos de sacarose, glicose e frutose, de modo a evitar a contaminação do trabalho experimental por formigas, bactérias ou fungos.

Se as cabeças da bomba peristáltica do FIA forem deixadas fechadas, os tubos rapidamente ficarão permanentemente deformados provocando uma diminuição significativa do caudal bombeado. Assim, deixe sempre as cabeças da bomba peristáltica abertas. Direccione as duas válvulas dos reactores para a posição livre, não ligada a nenhum reactor, e abra também a cabeça da bomba peristáltica de alimentação aos reactores. Se não colocar estas válvulas na posição livre, ao abrir a cabeça da bomba peristáltica poderá permitir que o ar entre no reactor correspondente.

Coloque os balões contendo as soluções-padrão no frigorífico. Passe a solução enzimática contida no frasco de saída para o frasco de entrada. Coloque a enzima no frigorífico. Coloque ainda o reactor enzimático (reactor vermelho) no frigorífico. Deixe os tubos do FIA cheios de água destilada. Estes procedimentos visam diminuir a biodegradação das soluções de sacarose, glicose e enzima usadas. Os padrões são refeitos todas asa semanas, bem como a solução enzimática e o enchimento do reactor enzimático. A resina de permuta iónica é regenerada anualmente usando uma solução de ácido clorídrico concentrada, ≈2M.

NotaAs soluções-padrão de glicose e a solução enzimática deverão ser retiradas do frigorífico cerca de duas horas antes do início duma nova experiência. De facto, se retirarmos estas soluções do frigorífico imediatamente antes da experiência, estas tendem a libertar ar dissolvido (desgaseificação), devido ao aquecimento no ar ambiente, introduzindo ar no sistema de análise, FIA, e prejudicando fortemente o decorrer da experiência. Este procedimento tem, no entanto o inconveniente de diminuir a validade destas soluções, motivado pelo aceleramento da sua biodegradação.

No final da experiência, calcule a conversão em estado estacionário para cada um dos reactores, e determine, para os catalisadores de resina de permuta catiónica, as respectivas constantes cinéticas, factores de eficiência e módulos de Thiele. Compare o desempenho dos três reactores.

Todas as medições experimentais vêm afectadas de um erro, o erro experimental. Faça uma análise de sensibilidade para determinar onde os erros experimentais afectam mais significativamente os resultados. Por exemplo: será que a variação de 1ºC na temperatura do meio reaccional afecta significativamente a determinação da constante cinética? Para isso precisamos de saber, ou ter uma estimativa, da energia de activação da reacção e fazer uma análise de sensibilidade. Se a constante cinética for muito sensível à temperatura, deveremos ter muito cuidado no seu controlo. Na preparação do trabalho, faça um estudo de sensibilidade às principais variáveis que afectam o cálculo da constante cinética, do factor de eficiência η e do módulo de Thiele Φ.

Nota – Faz-se notar que deveremos obter sempre k1/k2≤r02/r01, sendo r02/r01≥1, caso contrário estamos perante uma impossibilidade física.

Dados sobre os reactores catalíticos:

  • diâmetro interno – 2,5 x 10-2 m;
  • comprimento máximo (o comprimento útil é variável por manipulação do pistão) – 0,25 m;
  • porosidade do reactor amarelo – 0,52;
  • porosidade do reactor verde – 0,59;
  • porosidade do reactor vermelho (valor estimado) – 0,4;
  • diâmetro médio volumétrico da resina maior (na forma protónica) – 8,8 x 10-4 m;
  • diâmetro médio volumétrico da resina menor (na forma protónica) – 3,1 x 10-4 m;
  • concentração de centros activos por unidade de volume da coluna–1,9 meq cm-3[5];
  • diâmetro médio volumétrico do alginato de cálcio – 3,0 x 10-3 m;
  • massa específica aparente da resina – 1,27 g cm-3.

 

3. Ilustração do tratamento de resultados experimentais

Os seguintes resultados experimentais não pretendem ser reais, são antes os dados necessários à ilustração do tratamento matemático que se pretende fazer.

Na Figura 6 podemos ver uma fotografia da instalação experimental em funcionamento. Na Tabela 2 são apresentados os dados operacionais do sistema reaccional. A temperatura do reactor do sistema de análise FIA foi de 20ºC.

Tabela 2 – Dados operatórios do sistema reaccional

Reactor Concentração da solução de sacarose (g dm-3) pH da solução de alimentação Comprimento útil da coluna (cm) Caudal de alimentação (cm3 min-1) Temperatura da camisa de aquecimento
Amarelo 7.6 7 20.6 14.67 70°C
Verde 7.6 7 20.4 13.29 70°C
Vermelho 7.6 4.6 19.5 11.33 55°C

 

Fotografia dos reactores da instalação experimental. Da esquerda para a direita: reactor amarelo, verde e vermelho
Figura 06: Fotografia dos reactores da instalação experimental. Da esquerda para a direita: reactor amarelo, verde e vermelho.

A calibração do sistema de detecção foi feita usando quatro soluções-padrão de glicose. Foram feitos dois ensaios concordantes. Os dados relativos à calibração são apresentados na tabela 3.

Na Figura 7 é apresentada a curva de calibração. Os pontos experimentais foram ajustados a um polinómio do segundo grau: A = -0,05988xC2+0,6094xC+0,010351, sendo A absorvância e C a concentração de glicose em g dm-3. Faz-se notar que os valores de maior precisão deverão ser colocados no eixo dos xx (neste caso a concentração das soluções-padrão) e de menor precisão no eixo dos yy (neste caso a absorvância lida) [e.g. 8]. A equação da curva de ajuste deverá ser agora apresentada sob a forma C = f(A), ou seja, C= 5.0885 - √26.0658-16.7001xA tornando possível a sua utilização directa na obtenção da concentração em função dos valores de absorvância lidos.

Tabela 3 – Dados relativos à calibração do sistema de detecção, FIA

 Concentração em glicose  (g/dm3)  Altura do pico registado/Absorvância máxima
1ª leitura
2ª leitura Média
1.008 0.567 0.565 0.5660
2.029 0.996 0.991 0.9935
3.020 1.314 1.309 1.3115
4.015 1.491 1.488 1.4895

Curva de ajuste dos pontos de calibração obtidos
Figura 7: Curva de ajuste dos pontos de calibração obtidos.

Depois da calibração do sistema de detecção, procedeu-se à determinação da conversão em estado estacionário dos três reactores. Os resultados obtidos, sob a forma de altura dos picos registados e da conversão em estado estacionário, são apresentados na Tabela 4.

Tabela 4 – Conversão em estado estacionário dos reactores amarelo, verde e vermelho


Reactor
Altura /Absorvância máxima do pico registado (cm [absorvância]-1)
Conversão (%)
1.ª leitura 2ª leitura Média
Amarelo 1.071 1.075 1.073 55.8
Verde 1.425 1.421 1.423 89.3
Vermelho 1.276 1.260 1.268 71.9

A partir da conversão em estado estacionário relativa aos três reactores é possível calcular a constante cinética aparente dos reactores amarelo e verde baseada no volume total do reactor, assumindo escoamento pistão ou pistão com dispersão axial, em que o Peclet é estimado através de um modelo. Neste trabalho usamos o modelo proposto por Chung e Wen [4], admitindo que a viscosidade e a massa específica da solução reagente tem a mesma viscosidade e massa específica da água a 70ºC, ou seja μ = 4.07 x 10-4 kg m-1 s-1 e ρ= 977.9 kg m-3 [9]. Na Tabela 5 apresentamos as constantes cinéticas estimadas para escoamento pistão e escoamento pistão com dispersão axial.

Tabela 5 – Constante cinética aparente relativa aos reactores amarelo e verde

Reactor Temperatura (ºC) Tempo de passagem (s) (baseado no volume total do reactor) Pe Constantes cinéticas (s-1)
Modelo pistão Pistão com dispersão
Amarelo 70 413.6 95.11 1.98x10-3 1.99x10-3
Verde 70 452.9 230.3 4.95x10-3 4.99x10-3

Relativamente aos reactores de leito fixo com enchimento de resina de permuta catiónica, sob a forma protónica, e com diâmetros diferentes (reactores amarelo e verde), é ainda possível obter os respectivos factores de eficiência e os módulos de Thiele. Estes valores são apresentados na tabela.

Tabela 6 – Factores de eficiência e módulos de Thiele relativos aos reactores amarelo e verde.

Reactor Diâmetro médio do catalisador (mm) Factor de eficiência η Módulo de Thiele Φ
Amarelo 0.88 16.9% 16.6%
Verde 0.31 42.5% 5.9%

A curva de calibração ajusta bem os pontos experimentais da curva de calibração, indicando que esta terá sido bem obtida. Embora as constantes cinéticas aparentes sejam muito sensíveis a pequenos erros na medição dos caudais de alimentação aos reactores e à curva de calibração, os resultados obtidos em termos de factores de eficiência e módulo de Thiele são, pelo menos, coerentes. Assim, o reactor amarelo apresenta um menor factor de eficiência, uma vez que apresenta as partículas de catalisador maiores, enquanto o reactor verde apresenta um factor de eficiência maior. É difícil de prever a conversão em estado estacionário do reactor vermelho, já que esta depende também de factores fracamente controlados na presente experiência. Assim, não é controlada a biodegradação da invértase no reactor, a quantidade de invértase imobilizada no alginato de cálcio e originalmente introduzida no reactor, nem a porosidade do reactor, que vão variando de experiência para experiência. No caso presente, a conversão do reactor enzimático está entre a conversão dos reactores amarelo e verde.

 

4. Cuidados especiais:

Embora nenhum dos reagentes (sacarose, frutose, glicose e enzimas) usados nesta experiência sejam perigosos, mantenha os procedimentos de segurança habituais.

Verifique sempre antes de começar o trabalho experimental se a banca está limpa e livre de material sujo ou desarrumado. Limpe-a e arrume o material, se for caso disso.

Deixe sempre a banca arrumada. Tenha especial cuidado em não deixar recipientes com soluções na banca de trabalho, nem material sujo.

Etiquete todos os recipientes utilizados, usando etiquetas ou um marcador. Note que é fácil confundir um gobelé com água com um contendo ácido clorídrico. No final, retire as etiquetas antes de colocar o material para ser lavado.

Um dos maiores inimigos da segurança é o cansaço. Um operador cansado relaxa as normas de segurança e tem reflexos mais lentos. O acidente pode então acontecer a qualquer momento. Preste sempre atenção às normas de segurança. Estas poderão evitar-lhe um acidente no presente e no futuro!!!

 

5. Materiais:

Material de vidro/ plástico:

  • 4 matrazes de 500 cm3;
  • 1 proveta de 10 cm3;
  • 1 proveta de 50 cm3.

Outro material:

  • 1 rolo papel absorvente;
  • etiquetas e marcador;
  • esguicho;
  • termómetro;
  • 1 par óculos de protecção;
  • 1 cronómetro.

 

6. Deposição de resíduos:

 Os resíduos de sacarose, frutose, glicose e enzimas são biodegradáveis e assim podem ser depositados em segurança no esgoto.

Referências

[1] Reed, E.; J. Dranoff, “Ion Exchange Resin Catalysis of Sucrose Inversion in Fixed Beds”, I&EC Fundamentals, 3, 303-307, 1964.

[2] Gilliland, E.; H. Bixler; J. O’Connell, “Catalysis of Sucrose Inversion in Ion-Exchange Resins”, Ind. Eng. Chem. Fundam., 10, 185-191, 1971.

[3] Ruthven, D., “Principles of Adsorption Processes”, John Wiley & Sons, NY, 1984.

[4] Chung, S. F. e C. Y. Wen, “Longitudinal Dispersions of Liquid Flowing Through Fixed and Fluidized Beds’’, AIChE Journal, 14, 857-866, 1968.

[5] Helfferich, F., “Ion Exchange”, McGraw-Hill, NY, 1962.

[6] Rodrigues, A. E., “Theory of Residence Time Distribution”, em Multiphase Chemical Reactors, vol. I, Fundamentals, editado por A. E. Rodrigues, J. M. Calo e N. H. Sweed, Nato Advanced Study Institute Series, n. º 51, Sijthoff Noordhoff, 225-284, 1981.

[7] Harris, D. C., “Quantitative Chemical Analysis”, Freeman, 3. ª ed., NY, 1991.

[8] Chapra, S. C.; Canale, R. P., “ Numerical Methods for Engineering”, McGraw-Hill, 3. ª ed., Boston, Cap. 17, 1998.

[9] J. P. Holman, “Heat Transfer”, McGraw-Hill, NY, 8. ª ed., 1997.

[10] Levenspiel, O., "Chemical Reaction Engineering", Third Edition, John Wiley & Sons, NY, 1999.

 

Agradecimentos

Agradeço à empresa VICODI a amabilidade de ter oferecido as amostras de resina necessárias à realização do presente trabalho.

 
 
 
in:
  1. Mendes, A., “Laboratórios de engenharia Química – Reactores em Fase Homogénea, Reactores Catalíticos, Separações não Convencionais e Tecnologia de Sólidos Divididos”, FEUP- Edições, 16 capítulos, 2002
 

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