No desenvolvimento de um bioprocesso como num qualquer processo químico poderemos considerar genericamente três grupos de operações: a reacção, as operações a montante, de preparação dos reagentes (matérias primas), e operações a jusante da reacção (operações unitárias) para separação de produtos (Fig. 1). É hoje evidente a grande interdependência mútua das diferentes operações. Cada etapa do processo de separação depende da história do produto desde (incluindo) a produção que, por sua vez, depende das operações a montante.
As operações a montante da reacção para preparação das matérias-primas são umas de carácter mecânico (por exemplo, moagem, mistura), outras são de carácter químico (e.g., hidrólise ou a formulação do meio de cultivo de microrganismos) e outras ainda são de carácter físico (é o caso da esterilização dos caldos de cultivo ou a descontaminação do ar por processos como a filtração por membranas ou em filtros de fibras). A montante da reacção há ainda a considerar a selecção de micro-organismos produtivos, a sua adaptação às condições de cultivo (que determinam a fisiologia de crescimento), a preparação dos inóculos, o desenvolvimento de meios de cultivo (mais caros e quimicamente mais bem definidos, uns, ou mais baratos e indefinidos, derivados de agroindústrias, outros), a tecnologia de esterilização dos caldos, entre outros, que constituem, todos eles, factores que afectam não só a produção mas também os processos de separação. A selecção dos organismos produtivos deverá ter em conta caraterísticas como, por exemplo, a morfologia, o tamanho e a floculabilidade (que determinam as técnicas de separaçãp sólido/líquido), tendência de adesão a superfícies sólidas, rigidez da parede celular (afecta a eficiência de desintegração), etc. A tecnologia de DNA recombinante tem sido sobretudo usada para aumentar a produtividade da fermentação, devendo, porém, ser hoje de algum modo re-orientada para facilitar e melhorar as operações de separação (por exemplo, na construção de proteínas de fusão com vista a uma separação de afinidade por ligação bio-específica a uma matriz adequada).
Figura 1 – Grupos de operações no desenvolvimento de um bioprocesso
A pureza dos materiais, os aditivos condicionantes do meio de reacção (e.g., anti-espumas químicos) e a tecnologia de reacção (fermentação) podem condicionar a selecção dos métodos de isolamento e purificação dos produtos alvo e respectivos rendimentos.
As operações de concentração e purificação dependem também elas umas das outras para além de dependerem de todas as que lhes estão a montante. A título de exemplo, a desintegração de células para recuperação de produtos intracelulares, não segregados para o meio de suspensão, produzirá detritos de parede celular que são extremamente difíceis de separar em algumas situações e que podem afectar drasticamente os processos de separação com membranas e, muito particularmente, as operações cromatográficas.
A concepção racional e a economia de um processo, globalmente entendido, assumem, assim, uma importância vital.
Os reactores biológicos são tanques, em geral fechados, com dispositivos para entrada de soluções de matérias-primas e catalisadores e saída de produto, com dispositivos de agitação e mistura, e sistemas de circulação de vapor (para esterilização do conteúdo e do próprio tanque), e de circulação de água (para extracção de calor da bio-reacção) (Fig. 2).
Os bio-catalisadores poderão ser células ou bio-moléculas dotadas de poder catalítico (enzimas) designando-se genericamente por fermentadores, no primeiro caso, e reactores enzimáticos ou, mais genericamente, bio-reactores, no segundo caso.
Figura 2 – Esquema genérico de um bio-reactor
Os fermentadores deverão ainda dispor de sistemas de medida e controlo de variáveis ambientais, as mais das quais são o pH, a temperatura, o oxigénio dissolvido (no caso de cultivo aeróbio), potencial redox e espumas.
Interface de comunicação entre o operador e o fermentador (by courtesy of Bioengineering AG, Switzerland).
Para a recuperação do produto alvo tem as células deverão ser separadas do meio de cultivo e ou o produto é segregado para o meio ou permanece no interior das células, sendo que as próprias células poderão ser elas próprias produto como no caso do fermento dos padeiros (Figura 3a). Se o produto é intracelular então a parede das células terá de ser partida ou de algum modo permeabilizada. Uma vez extraído/solubilizado o produto o processo de concentração, isolamento e purificação prossegue através de um conjunto distinto de operações unitárias como se ilustra na Figura 3b.
Figura 3a – Extracção do produto
Quando o produto é intracelular a recuperação de células é feita normalmente por centrifugação, microfiltração ou ultrafiltração; outras técnicas podem ser também usadas, como a filtração em vácuo, filtração compressiva ou flotação, e são-no particularmente para remoção de biomassa quando o produto é extracelular.
Quando o produto é retido no ambiente intracelular a desintegração da parede das células pode ser feita por homogeneização mecânica, em moinhos de bolas ou choque osmótico. As células de parede mais resistente poderão ser permeabilizadas ou enfraquecidas por métodos químicos, físicos ou enzimáticos antes de serem submetidas a acções mais energéticas dos métodos mecânicos. Na desintegração extensa da parede celular resultam micro detritos celulares que deverão ser separados para não causar problemas sérios nas operações seguintes de concentração/isolamento e purificação dos produtos. A separação dos resíduos de parede da célula pode ser feita por centrifugação, microfiltração com escoamento tangencial, podendo ainda usar-se filtração em vácuo ou filtração compressiva.
Para a solubilização/extracção dos produtos, que antecede a separação dos resíduos celulares, pode usar-se solventes orgânicos, sistemas bifásicos aquosos, fluidos supercríticos, adsorção, micelas invertidas ou, em certos casos, destilação.
As soluções com os produtos solubilizados são muito diluídas e deverão ser concentradas para remover quantidades apreciáveis de meio de solução. As operações envolvidas permitem simultaneamente remover muitos produtos não desejados. Esta fase do processo pode ser conseguida geralmente por técnicas como ultrafiltração, evaporação, osmose reversa, precipitação, cristalização, extracção, ou adsorção.
Figura 3b – Isolamento e purificação do produto
Produtos que requerem um grau de purificação mais elevado para extensa remoção de pequenas doses de contaminantes terão de ser submetidos a operações complementares como cromatografias (de filtração em gel, de permuta iónica, de interacção hidrofóbica, de afinidade ou pseudo-afinidade, de adsorção, entre outros tipos de cromatografia), diafiltração, electrodiálise, electroforese ou cristalização. Os produtos que não requerem um tão elevado grau de pureza devrão, contudo, ser desidratados ou quaisuqer resíduos de solventes deverão ser removidos por qualquer técnica de secagem como spray-drying, freeze drying, ou leitos de enchimento.
Bio-reactor de alta pressão para cultivo de células com elevada densidade celular (by courtesy of Bioengineering AG, Switzerland).
